Ni-NTA琼脂糖纯化树脂

产品介绍
新赛美 Ni-NTA 琼脂糖凝胶（Ni-NTA Agarose）是一种预装了镍离子（Ni²⁺）的亲和层析纯化介质。其基质为 6%的高度交联琼脂糖凝胶，通过化学方法偶联了四齿螯合剂次氮基三乙酸（NTA）作为配体。该配体能高效螯合 Ni²⁺离子，形成非常稳定的八面体结构，可与 6×His 标签蛋白发生特性结合，从而实现目标蛋白的高效分离与纯化, NTA 配体含有四个螯合区，相比传统的三齿螯合剂（如 IDA），能与 Ni²⁺结合得更牢固，有效防止纯化过程中金属离子的脱落。

技术参数


各试剂与 Ni-NTA 纯化树脂兼容性



纯化流程
缓冲液准备
所有缓冲液须用高纯水配制，使用前建议用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤。
推荐使用的缓冲液配方：

缓冲液注意事项：
建议在含 0.5~1.0 M NaCl 的缓冲液中进行结合，中性至弱碱性 pH 7~8 条件效果最佳，常用磷酸钠缓冲液
也可使用 Tris-HCl 缓冲液，但在金属-蛋白质亲和力较弱时应避免使用，因其可能降低结合强度
样品准备
可溶性蛋白样品：细胞裂解后离心（12,000 rpm，4℃，20~30 分钟），上清用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤后上样
包涵体蛋白样品：在所有缓冲液中加入 6 M 盐酸胍或 8 M 尿素
样品缓冲液应尽可能与平衡缓冲液一致
根据介质载量和料液中目标蛋白含量计算进料量
细胞裂解与样品澄清
裂解方法：常用方法包括超声破碎或高压匀浆。为防止蛋白降解，裂解缓冲液中建议加入适量的蛋白酶抑制剂。如果样品中核酸过多导致粘稠，可加入 DNase I（终浓度 5 μg/ml）和 Mg²⁺（终浓度 1 mM），冰上孵育 10-15 分钟以降低粘度。
澄清处理（非常关键）：裂解后，必须彻底去除细胞碎片等不溶物，以防堵塞柱子。建议首先以 10,000-15,000×g 的离心力，在 4℃下离心 20-30 分钟，取上清。为确保效果，上清液最好再通过 0.45μm（或 0.22μm）的滤膜过滤
以下是使用预装柱进行纯化的一般步骤。
准备：将所有试剂恢复至室温。根据说明书建议的柱体积（CV）计算各缓冲液用量。
平衡：用 5-10 个柱体积的平衡缓冲液（不含或含低浓度咪唑，如 10mM）冲洗层析柱，直至流出液的 pH 和电导率与平衡液一致。
上样：将处理好的样品以适中流速（推荐 60-100 cm/h）加入层析柱，使目标蛋白与 Ni²⁺充分结合。建议收集流穿液以备分析。
洗涤：上样后，用 10-15 个柱体积的洗涤缓冲液（平衡液中加入 10-40mM 咪唑）清洗柱子，去除非特异性结合的杂蛋白。
洗脱：用 5-10 个柱体积的洗脱缓冲液（平衡液中加入高浓度咪唑，如 250-500mM）将目标蛋白竞争下来。建议分段收集洗脱液（例如每 1 个柱 体积收集一管），以便后续通过 SDS-PAGE 等分析确定目标蛋白所在组分。

再生与保存
当以下情况出现时，建议进行彻底再生：
结合能力显著下降
镍离子渗漏明显
非特异性吸附增加
再生操作
（1）从层析柱下端流干所有溶液
（2）用 2 倍柱体积的 0.2 M Acetic Acid / 6 M Guanidine HCl 洗涤
（3）用 2 倍柱体积的去离子水 洗
（4）用 3 倍柱体积的 2% SDS 洗涤
（5）依次用 1 倍柱体积 50%、5 倍柱体积的 100%乙醇进行梯度洗涤
（6）再依次用 1 倍柱体积 的 25%乙醇洗涤
（7）用 1 倍柱体积的去离子水洗涤
（8）用 5 倍柱体积的 0.1 M EDTA（pH 8.0） 洗涤
（9）用 3 倍柱体积的去离子水洗
（10）用 5 倍柱体积的 100 mM NiSO₄·6H₂ O（或 100 mM NiCl₂）洗涤
（11）用 10 倍柱体积的平衡缓冲液,洗去游离镍离子，柱子即可再次使用
（12）如需长期保存，再生后加入 1 倍柱体积的 20%乙醇，封住上下端口，在 4℃ 保存。下次使用前需重新执行挂镍步骤。
快速再生法
（1）适用于常规清洁（无镍离子去除）
（2）每次纯化完成后，建议执行以下快速清洗：
（3）用 0.5 M 咪唑缓冲液 洗涤 5 个柱体积
（4）用 去离子水 洗涤 5 个柱体积
（5）用 1-2 M NaCl 溶液 洗涤 5 个柱体积
（6）用 去离子水 洗涤 5 个柱体积

常见问题与解决方案