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细胞生物学系列产品

Cell Counting Kit-8

CCK-8试剂盒

货号:
C6050
规格:
5000T
目录价:
¥3124.00
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产品介绍

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒,是MTT,XTT等的替代方法,一种基于WST-8(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan。对于同样的细胞,颜色的深浅(生成的Formazan量)和细胞数目呈线性关系。可用于药物筛选、细胞增殖和毒性测定、肿瘤药敏等试验。

操作步骤

一. 制作标准曲线(测定细胞具体数量)

1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞;

2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做4-7个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔;

3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加入CCK-8试剂(按每100 μL培养基加10μL CCK-8)培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。(使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致)

 

二. 细胞活性检测

1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养一段时间;

2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡,它们会影响OD值的读数);

3.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时;

4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

 

三.细胞增殖-毒性检测

1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养24小时;

2.向培养板加入不同浓度的待测药物;

3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间;

4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡);

5.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时;

6.用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次, 然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

 

四.活力计算

细胞存活率*(%=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率*%=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As:实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液,不含药物

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液,不含细胞、药物


保存条件

4℃避光保存,有效期12个月;-20℃避光保存,有效期24个月

 

实验应用

1. 细胞增殖测定:CCK-8是水溶性的,在培养基中稳定且无毒。

2. 细胞活性分析,包括细胞毒性:代谢活性以及染料的形成与细胞的活性和损伤成比例。

3. 细胞因子分析:测定细胞因子诱导的增殖,必要时,可在试验结束时回收和扩增细胞

 

注意事项

1.CCK-8的培养时间一般为1-4小时,但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度,根据细胞种类而定,需要摸索条件,CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

2.使用96孔板进行检测时,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问 题。一方面,由于96孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加相同量的PBS,水或培养液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。

3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。

4.加入药物中如含有金属,对 CCK-8 显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%,15%,90% 的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话,将会100% 抑制。

5.培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

6.本产品可以检测革兰氏阴性细菌,但不能检测革兰氏阳性细菌和酵母细胞。向100μL培养液中加入10μL CCK-8溶液,并培养1-4小时或过夜。

7.CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深,OD值不断增加(注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。

8.要测定细胞的具体数量,建议同时做标准曲线。

9.建议采用多通道移液器,以减小平行孔间的差异。

10.以下方法可以终止CCK-8反应(96 孔板):(a).在显色反应后,将培养板放置4°C冰箱内。(b).每孔加10μL 0.1M HCl溶液。(c).每孔加10μL 1% (w/v) 的SDS (十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时内测定。

11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。

12. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。



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